Bito - Klonierung

Klonierung

VL1

Grundlage Isolierung, Klonierung, Anaylse von Genen:
 * Trennung der Gene
 * Selektive Vermehrung (vitro (PCR), vivo (Vektoren))
 * Ligation
 * Transformation
 * Selektierbarkeit (Marker)

Pro E. coli
 * Billiges Nährmedium
 * Generationszeit
 * Vektoren (Plasmide)
 * Gute Transformation mit Plasmiden
 * Leicht mit Phagen zu infizieren
 * Plasmiden leicht von chrDNA trannbar
 * K12-Laborstämme
 * Voll sequenziert (4600)

Restriktionsendonukleasen 3 Typen

Typ II – Restriktionsenzyme erzeugen verschiedene Enden
 * EcoRI  sticky, 5’ overhang, GAATTC
 * EcoRV  blunt
 * PstI  sticky, 3’ overhang

Methylierung in E. coli
 * EcoKI  Restriktion fremder DNA
 * DAM (methyliert an Adenosin)  DNA-Reparatur
 * DCM  nich bekannt

Methylierung in Eukaryoten (Methyliere Promotoren inaktiv, Inaktivierung von Repetitiven Sequenzen)
 * Hefe keine
 * Wirbeltiere  an Cytosin (CG)
 * Pflanzen  an Cytosin (CNG)

VL2

Vektoren

Plasmide:
 * Zirkulär, ds DNA
 * Unabh. Repliziert
 * Resistenzen
 * Konjugation

Konjugation:
 * Tra-Gene (Pili-Synthese)
 * Mob-Gene (Mobilisierungsproteine)
 * Nick/bom-Gene (oriT(ransfer) = Mobilisierungsstelle)
 * Vorgang: mob-Prot. bindet an nick/bom  Relaxationskomplex  Strangbruch  ssDNA übertragen

Replikation und Verteilung
 * Unidirektional u. > bidirektional
 * oriV = Replikationsursprung
 * Kopienzahl:
 * Bei pMB1 (ColE1) Replikationskontrolle durch selbst synthetisierte RNA (Hybridbildg)
 * Rop-Protein (repressor of Primer)  stabilisiert Hybridbildg.  repl. Senkung
 * Relaxiert kontrollierte Replikation  hohe Kopienzah, Stringent kontr. Repl.  geringe Kopzahl.
 * Verteilung:
 * Gleichmäßige Verteilung auf Tochterzellen = Stabilität eines Plasmid
 *  par-Loci (partition)
 *  cis Lokus  Anheftg. Der Plasmiden an Membran

Zusammenhänge für Plasmiden:
 * je kleiner Plasmid, desto höher Kopienzahl
 * je niedriger Kopienzahl, desto höher Stabilität
 * kleine Plasmide  geringe Stabilität

Inkompatibilität und Wirtsbereich
 * Inkompatibilitätsgruppen (Inc) = Verwandte Plasmide  nicht stabil repliziert u. weitervererbt
 * Da: = Replikationsaparat (oriV), = Elemente f. Kopienzahl, = Elemente f. Verteilung
 * Narrow host range (z.B. ColE1)
 * Broad host range (RK2)  shuttle-Vektoren

Antibiotike und Resistenz:
 * Metabolite mit nierigem Molekulargewicht (1000 D)
 * Hemmen Wachstum  inhibieren essentielles Makromolekül
 * Mechanismen der Resistenz
 * Mutation des Zielproteins
 * Erhöhte Produktion des Zielproteins
 * Chem. Veränderung der anbak. Substanz
 * Verhinderung der Aufnahme

Antibioika Wirkungsweise:
 * Beta-Lactam-Antibiotika: Ampicillin, Bak., Inhib. Zellwand-Synthese, spaltung beta-Lactam-Ring durch beta-Lactamase
 * Tetracycline, Bak., Inhib. Proteinsynthese (ribosomale Proteine), Aufnahme verhindert durch Membranproteine
 * Aminoglycoside: Kanamysin, Bak./Euk., Inhib. Proteinsynthese
 * Chloramphenicol, Bak., Inhib. Proteinsynthese, Acetylierung durch CAT
 * Blemocin-Familie, Bak/Euk, DNA-Degration, Bindg. Des Antibitotikums

Eigenschaften Klonierungsvektoren:
 * Autonome Replikation
 * Klein (bessere Effizienz v. Ligation)
 * Selektionsmarker
 * Keine Restriktionsstellen abseits der Insertstelle
 * Viele singuläre Restriktionsstellen bei Insertstelle
 * Singuläre Restriktionsstelle in Marker (Resistenzgen)  Inaktivierung bei Insert
 * Hohe Kopienzahl (pBluescript 100)
 * Verbreitung nicht über Konjugation

pBR322-Vektor:
 * PstI (Schnittstelle=Klonierungsstelle) in Ampicillin-Resistenz-Element (ApR)
 * Tetracyclin-Resistenz (TcR)
 * Identifizierung von Rekombinanten mit pBR322 (siehe Buch)
 * Nachteile
 * Relativ Groß
 * Wenige Schnittstellen
 * Selektion umständlich (Stempeln)
 * Keine zusätliche Schnittstelle neben Klonierstelle (für Removing)

Lac-Operon: Repression durch Lac-Repressor:
 * lacZ  beta Galactosidase (Lacrosespaltung  Glucose)
 * lacY  Lactose-Permease (Lactoseaufnahme)
 * lacA  Transacetylase (entgriftet toxische Galactoside)
 * lacI gehört nicht zum Operon  Lax-Repressor (bindet an Lac-Operon, verhindert Transkription)
 * natürlicher Indukor (Gegeteil v. Inhibitor) = Allolactose (v. beta Galactosidase gebildet)